培养原代细胞三抗是什么(细胞原代培养结果与讨论)

原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢？

实验环境稳定，温度适宜，原代细胞健康，在满足这些条件后，再等待一段时间，即可进行栽培，这样才可以构建稳定的细胞株。

培养原代细胞三抗是什么(细胞原代培养结果与讨论)

我认为可以，当然想要构建成功也不是件容易的事情，肯定要满足一定的物理条件和化学因素，不然没有构建成功，反而失败了。

能。因为原代的细胞也具有细胞的一切特性，所以也能够构建稳定的细胞株。

原代细胞构建稳定细胞株需要什么条件？

通常，G418 生效一周，嘌呤 2－3 天。脂质体单克隆的筛选时间长且效率低，仅约 1％。转染， 首先包装细胞，通常是 293 个细胞，以包装，然后用转染靶细胞。

实验环境稳定，温度适宜，原代细胞健康，满足了这几个条件后，等待一些时间，就可以进行培育了。

原代细胞构建稳定细胞株是需要在特定的环境中才行，环境要符合原代细胞的构造，而且周围的原代细胞不能出现任何的破损情况。

动物细胞培养技术的内容

《动物细胞培养技术》结合细胞培养技术的研究进展，全面而系统地介绍了细胞培养的理论和作方法。内容包括：细胞培养的准备，细胞培养技术，培养细胞研究技术和显微摄影技术。实验方案编写突出作技能培养和实验成败分析。

原代培养的基本介绍

原代培养也称初代培养，严格地说即从体内取出组织接种培养到次传代阶段，但实际上，通常把代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测物很好的实验对象。

传代细胞的培养步骤

1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。 4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。5．点燃酒精灯；取出无菌，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌内。 6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。8．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

传代细胞的培养步骤如下：

(1)人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手；

(2)细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察；

(3)打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧；

(4)超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净；

(5)贴壁细胞的传代；

(6)半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代。

适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。幼年动物的肾、肺、肝、卵巢、上皮、肌肉与肿瘤等组织的细胞较易培养，而神经细胞则较难培养。原代细胞基础上通过胰酶等物质消化后继续用于细胞培养的细胞，它与原代细胞具有相同核型。这类细胞在体外可以无限制分裂。

拿到的细胞，如果是冻存的，首先要复苏，步骤是，取出立刻用37摄氏度水浴溶解，然后离心去冻存液，加入十倍体积的培养液，悬浮，离心去培养液，再加入培养液，转入培养瓶培养即可。关键是快速解冻。

传代是细胞在培养瓶中长满后，去培养液，胰酶消化使细胞脱壁，转入离心管离心，去消化液，用培养液悬浮，取部分细胞悬液（按需要）接入新的培养瓶，加入足够的培养液培养即可。

原代细胞培养和传代培养的方法及其:细胞培养和传代

初代培养 原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：动物组织块

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

传代培养法

原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1. 细胞：贴壁细胞株

2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

无菌作注意事项

1. 作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2. 点燃酒精灯，作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3. 作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。

初代培养 原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：动物组织块

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

传代培养法

原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1. 细胞：贴壁细胞株

2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

无菌作注意事项

1. 作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2. 点燃酒精灯，作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3. 作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。

初代培养 原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：动物组织块

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

传代培养法

原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1. 细胞：贴壁细胞株

2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

无菌作注意事项

1. 作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2. 点燃酒精灯，作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3. 作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。

初代培养 原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

仪器、材料及试剂

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：动物组织块

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培养法

1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞

团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

初代组织块培养法

1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

传代培养法

原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1. 细胞：贴壁细胞株

2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

无菌作注意事项

1. 作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2. 点燃酒精灯，作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3. 作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。

细胞培养中加入双抗的作用是什么?双抗又是什么?

1、双抗是什么？

双抗就是青链霉素混合液,青链霉素混合液(100x)

(penicillin-streptomycin

solution），原代细胞产品专家齐氏生物认为，双抗是专门用于细胞培养的,可以直接添加到细胞培养液内.青霉素-链霉素溶液(100x)中,青霉素的含量为10000u/ml,链霉素的含量为10mg/ml.

2、双抗起的作用？

抗生素,抑制细菌生长；避免细胞污染

3、双抗的浓度？

齐氏生物在细胞培养液中的青霉素的工作浓度为100u/ml,链霉素的工作浓度为0.1mg/ml.

希望能帮到你！