超分辨显微镜 超分辨显微镜的工作原理

超分辨荧光显微镜和普通荧光显微镜的区别

两者在工作原理及应用方面存在不同。分述如下：

超分辨显微镜 超分辨显微镜的工作原理

一、荧光显微镜

1、荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

2、荧光显微镜原理：

(A) 光源：光源辐射出各种波长的光(以紫外至红外)。

(B) 激励滤光源：透过能使标本产生萤光的特定波长的光，同时阻挡对激发萤光无用的光。

(C) 荧光标本：一般用荧光色素染色。

(D) 阻挡滤光镜：阻挡掉没有被标本吸收的激发光有选择地透射荧光，在荧光中也有部分波长被选择透过。 以紫外线为光源，使被照射的物体发出荧光的显微镜。电子显微镜是在1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。这种显微镜用高速电子束代替光束。由于电子流的波长比光波短得多，所以电子显微镜的放大倍数可达80万倍，分辨的小极限达0.2纳米。1963年开始使用的扫描电子显微镜更可使人看到物体表面的微小结构。

3、应用范围：用来放大微小物体的图像。一般应用于对生物、医、微观粒子等观测。

二、共焦显微镜

1、共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个 光电倍增管。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。

2、原理：传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

3、应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。

如何看待我国成功研制高端超分辨光学显微镜？具有怎样的意义和价值？

我觉得突破了高端大气上档次的技术，意味着我们有了进一步的研究世界的观光点，突破了我的直觉，实现了价值，高分贝是有挑战的，也是有意义的，可以深入探索的，还需要再接再厉，目前科研部已经完成，科学院是，精密的高端显微镜开发能力和科研开发团队，为我国高端显微镜的发展提供了系统的解决方案。

我觉得这是非常值得庆祝和纪念的事情，与我们所有的科研团队与的支持分不开的，因为他们足够的努力和；这会让我国的科研事业更上一层楼，而且还更加推进了我国的发展，并取得更多的世界性的科研成果与成就，让我国的科研发展和经济发展更上一层楼，具有很大的历史意义。

这会广泛的应用在生物学和医学研究的相关领域，这台显微镜能够给这些相关的领域提供不可代替的作用能够让我们的技术发展的更加前沿，这意味着我国科研技术的发展对于这种精密仪器的制造，也有了一定的成就。

我觉得非常好，是因为研究出超分辨光学显微镜之后可以带动生物学的发展和进步，之后可以让更多人掌握新技能，可以了解显微镜的光学核心部件，以及系统的研究过程。

我国成功研制高端超分辨光学显微镜具有怎样的意义和价值？

的意义就是对我们的科技产生了巨大的作用。

代表了我国在这方面有了实质性的突破价值。

无论是激光扫描共聚焦显微镜还是双光子显微镜，都无法摆脱衍射极限的限制，为了进一步探索微观世界，需要分辨率更高的显微镜。

无论是激光扫描共聚焦显微镜还是双光子显微镜，都无法摆脱衍射极限的限制

一就是代表了我国科技水平已经达到了一种新的高度，然后更方便地研究某些领域

当共焦显微镜横向扫描间距为1nm时能否实现横向超分辨？

提出一种新的图像复原式整形环形光横向超分辨共焦显微测量法.该方法首先利用二元光学器件,将高斯照明光束整形为环形光束,用于初步改善共焦显微镜的横向分辨力,然后利用基于似然估计法(maximumlikelihoodestimate,MLE)的单幅图像超分辨复原技术,重建测量图像的高频信息,来进一步改善共焦显微镜的横向分辨力.实验表明,当λ=632.8nm,N.A.=0.85时,该方法能使共焦显微镜获得优于0.1μm的横向分辨力.利用该方法建立的横向超分辨共焦显微系统除了具有显著的超分辨效果外,还具有低成本的优点,因而该方法为共焦显微系统横向分辨力的改善提供了一种新的技术途径.

简单讲，普通共聚焦显微镜的横向分辨率还是受到衍射极限的限制（不提STED/PALM等超分辨技术）。系统的点扩散函数由激发／荧光波长和数值孔径决定。即使扫描间距取得小过PSF,只不过像素点增加，而实际分辨率并没有增加。

取得像素点n>24之后分辨这两个峰值就没区别了。如果这恰好是两个相邻的爱丽斑，即使像素点取得再多，系统的分辨率也不会提高了。

光学显微镜的分辨率是多少

光学显微镜的分辨率为0.2微米。

首先，

不同的显微镜的分辨率有所不同，小分辨距离=0.61λ/NA，小分辨距离越小，分辨率越高，因此公由式可以看到提高物镜的数值孔径NA，或者缩短光的波长，都可以提高分辨率，可见光的范围大概在390nm-670nm，而空气中的数值孔径大小等于1，普通光学显微镜的极限分辨率是200nm左右。

目前由于科技的发展，已经出现了超分辨的光学显微镜，典型的就是SSIM（结构化照明显微术）和N-STORM（庄小威实验室的研究成果），分辨率分别达到了80nm和20nm（可以看蛋白质之间的相互作用）。

因此，目前光学显微镜的分辨率达到20nm

显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

当用普通的照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA

式中d——物镜的分辨距离，单位 nm。 λ——照明光线波长，单位 nm。 NA ——物镜的数值孔径 例如油浸物镜的数值孔径为1.25，可见光波长范围为400—700nm ，取其平均波长550 nm，则d=270 nm，约等于照明光线波长一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。

可见光范围内（400-700nm），分辨率为所用波长的一半。

光学显微镜 分辨率与光的波长

首先，

不同的显微镜的分辨率有所不同，小分辨距离=0.61λ/na，小分辨距离越小，分辨率越高，因此公由式可以看到提高物镜的数值孔径na，或者缩短光的波长，都可以提高分辨率，可见光的范围大概在390nm-670nm，而空气中的数值孔径大小等于1，普通光学显微镜的极限分辨率是200nm左右。

目前由于科技的发展，已经出现了超分辨的光学显微镜，典型的就是ssim（结构化照明显微术）和n-storm（庄小威实验室的研究成果），分辨率分别达到了80nm和20nm（可以看蛋白质之间的相互作用）。

因此，目前光学显微镜的分辨率达到20nm