流式细胞术实验目的 流式细胞术实验目的及意义

流式细胞术原理

流式细胞术是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。

流式细胞术实验目的 流式细胞术实验目的及意义

其特点是:，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。

流式细胞术的作用原理

利用流式细胞术快速的对单个细胞的理化性质进行定量分析和分选，主要通过几个步骤：制备单细胞悬液，用特异性荧光染料标记的抗体进行染色，经染色后的待测细胞在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下细胞呈单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下细胞会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，进行分析。

流式细胞术实验流程

单细胞悬液的制备：流式细胞术检测的对象一般是细胞，并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞。如果要检测组织中的细胞，须先将组织制备成单细胞悬液。如果该培养细胞是贴壁细胞，需用胰酶消化处理；如果是胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，直接将脏器用研磨制成单细胞悬液；如果是实体脏器（如肺脏、肝脏和肿瘤组），细胞之间结合较紧密，将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶进行细胞消化后再进行研磨。

荧光标记与上样：细胞悬液制成后，用特异性荧光标记的抗体与细胞上的抗原结合以达到对细胞荧光标记（染色）。在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

激光照射及荧光信号收集：流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦的光束垂直照射在样品流上，细胞上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

数据处理分析：荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，光信号转换为可被计算机识别的电信号。计算机把所测量的各种信号进行处理分析。内容引自

流式细胞术的应用范围

1. 临床诊断：比如白血病、淋巴瘤的分型；造血干细胞的检测；TBNK和

2. 实验研究：只要细胞或者微球的大小在流式检测范围内，都可以用流式来分析各种抗原的含量或代谢状态等。

3. 细胞分选：有分选功能的流式可以把不同的细胞筛选出来，以便进行下一步的研究。

流式细胞术，你这磨人的小妖精

流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

一、小妖精的成仙之路

二、样本类型

流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

三、工作原理

流式细胞仪主要由3部分组成：液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

四、流式细胞术的应用

五、作过程中的注意点

1、上机前处理

小心荧光淬灭

作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体

通用原则是：为表达弱的抗原选择染色指数的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。

六、数据分析

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射（FSC，反应细胞的大小）和侧向角散射（SSC，反应细胞颗粒度）。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。

流式图的种类非常多，常用的是流式直方图和流式散点图。

直方图

流式直方图只能显示一个通道的信息。

横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。

散点图

X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。

FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（左图）。

右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。

等高线和密度图

等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。

三维图

细胞试验中流式细胞术是用来干什么的，怎么用？ PBS溶液怎么配，请给出具体成分及用量。 谢谢大家！！

流式细胞术可以用来测细胞周期，测凋亡率和抗原情况。细胞经胰酶消化后用冰乙醇固定过夜，第二天用PI染料反应30分钟后就可以上机检测了。PBS（ph=7.4）配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g

流式细胞术的用途是什么

细胞或者其他颗粒状的物体可以被荧光标记的抗体或者替他荧光染料染色。当这些被标记的物体通过流式细胞仪的时候，激光照射，得到不同的激发光。

用途：1. 临床诊断：比如白血病，淋巴瘤的分型，可以指导治疗。检测干细胞的百分率，可以判断干细胞治疗的效果等等

2. 实验研究。根据前面所说的原理。只要可以被染色的，都可以用流式来分析。可以检查各种抗原的含量。代谢状态等等。

3. 细胞的分选。，根据染色的状态，可以把不同的细胞筛选出来，进行下一步的研究。

流式细胞术的基本原理

流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行分析和排序的技术。它是一种高通量、快速、、灵敏的细胞分析技术，被广泛应用于生物医学研究领域。流式细胞术的基本原理是通过细胞特异性荧光染色或其他标记技术，将细胞分为不同的群体，并利用流式细胞仪进行多参数分析和排序。

流式细胞术的基本步骤包括：

细胞样品的制备：将需要进行分析和排序的细胞样品制备成单细胞悬液，保证细胞在流式细胞仪中流动时不会聚集在一起。

细胞荧光染色或标记：利用荧光染料、抗体或其他标记技术，将细胞标记成不同的类型。每种标记有自己特定的激发波长和发射波长，可用于检测和区分不同类型的细胞。

细胞悬液的注射和流动：将细胞悬液通过注射器注入到流式细胞仪中，通过高速气流的作用将细胞分散并带动其流动，进入到流式细胞仪的检测区域。

细胞流式分析：细胞通过流式细胞仪的检测区域时，被激光束激发，产生荧光信号，同时检测器检测并记录荧光信号的大小和特征，以及细胞的散射光信号，从而对不同类型的细胞进行鉴定、分析和排序。同时，可以通过多参数检测和分析，得到更多的细胞信息。

细胞分选：根据需要，可以将不同类型的细胞进行分选，常用的分选方式有电荷静电分选、压缩空气分选、磁珠分选等。分选后的细胞可以用于进一步的实验或应用。

总之，流式细胞术的基本原理是将细胞标记成不同类型并通过流式细胞仪进行多参数分析和排序。它是一种高效、高通量、、灵敏的细胞分析技术，可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断、生物安全等领域。

流式细胞分析术的工作原理

流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。国外又把流式细胞计称作荧光激活细胞分选器(Flu-orescence Activated CellSorter,FACS)。美国Becton—Dickinson 公司生产的流式细胞计系列均冠以FACS字头。目前国内使用的仪器多为美国、西欧及日本等国的产品，国内有些单位也已研制成功，但尚无定型产品面市。