质粒小提原理 质粒小提原理和步骤

质粒小提试剂盒中的p1 p2 p3分别有什么作用

P1作用是悬菌，使菌体分散。

质粒小提原理 质粒小提原理和步骤

质粒小提原理 质粒小提原理和步骤

P2是强碱，作用是裂解菌体。

大提质粒和小提质粒的基本原理是一样的，都是通过一定的方法（如加碱裂解）使在细菌内大量扩增的质粒释放出来，经过去蛋白去RNA等一系列步骤纯化DNA，终将DNA提取出来。

配方是：

1 Mol/L Tris-Hcl（pH8.0） 25mL

0.5Mol/L EDTA-NaOH(pH 8.0) 20mL

20%葡萄糖 45mL

H2O 910mL

Rnase（RNA酶，zhi100U） 10-20uL

扩展资料：

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜（超滤柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

参考资料来源：

什么是质粒大提 小提

质粒大提指质粒DNA的大量制备，包括在丰富培养基中扩增质粒、细菌的收获和裂解几个步骤。

质粒小提指质粒DNA的小量制备，包括细菌的收获和裂解。

质粒大提指质粒DNA的大量制备,质粒小提指质粒DNA的小量制备.

小量一次提取质粒DNA的原理是什么？

小量提取质粒DNA的原理主要包括:1. 裂解细胞和核糖体,释放出质粒DNA。常用SDS和蛋白酶K破坏细胞结构,裂解细胞和核糖体,释放出各种DNA,包括质粒DNA、宿主染色体DNA等。2.去蛋白。添加洗脱液如酚/等有机溶剂,可以去除相关蛋白质,留下DNA。3.沉淀DNA。加入苏木素和,可以使DNA选择性沉淀,此时质粒DNA和宿主DNA会同时沉淀。4.选择性吸附。使用硅柱等吸附质粒DNA,洗脱掉宿主DNA。硅柱对质粒DNA和宿主DNA有不同的亲和力,可以选择性吸附质粒DNA,洗脱宿主DNA。5.洗脱和浓缩DNA。用TE缓冲液等缓冲液洗脱硅柱,收集质粒DNA。可选用离心浓缩,得到小体积的质粒DNA溶液。6.可选的 PCR扩增。如果所得 DNA 浓度不够,可以使用 PCR 扩增获得更高浓度的质粒 DNA。所以,该方法通过裂解细胞,去蛋白,选择性沉淀和吸附等原理,实现了小量质粒DNA的提取,并通过 PCR达到了较高浓度,这就是小量提取质粒DNA的原理。

实验复盘四----重组质粒DNA小提

质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plaid Kit 离心柱型）--碱裂解法

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异地结合溶液中的DNA。

碱裂解法抽提质粒主要的试剂为溶液P1,P2,P3，其在抽提质粒DNA中的作用如下：

Prepare:

检查试剂盒里的试剂是不是都在，2mL灭菌离心管，涡旋振荡器，12000rpm离心机，ddH 2 O 65℃水浴锅预热，溶液P1保存在4℃冰箱中。

Reference:

1.分子生物学实验教程

2.天根质粒小提试剂盒说明书

质粒提取的基本原理

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

实验原理

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。

碱裂解法

人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

质粒小提试剂盒中的p1 p2 p3分别有什么作用

P1作用是悬菌，使菌体分散。

P2是强碱，作用是裂解菌体。

大提质粒和小提质粒的基本原理是一样的，都是通过一定的方法（如加碱裂解）使在细菌内大量扩增的质粒释放出来，经过去蛋白去RNA等一系列步骤纯化DNA，终将DNA提取出来。

配方是：

1 Mol/L Tris-Hcl（pH8.0） 25mL

0.5Mol/L EDTA-NaOH(pH 8.0) 20mL

20%葡萄糖 45mL

H2O 910mL

Rnase（RNA酶，zhi100U） 10-20uL

扩展资料：

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜（超滤柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

参考资料来源：

p3：溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，因为基硫酸钠遇到钾离子后变成了基硫酸钾 ，而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。【摘要】

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