pbmc分离方法及原理_分离pbmc用pbs稀释的目的

如何从PBMC中分离出CD4+T细胞

外周血CD4＋的分离。参照Dyanbeads CD4＋、CD25＋Tregs细胞分离纯化试剂盒说明书进行作。主要步骤如下：ficoll密度梯度法分离获得人外周血单个核细胞（PBMC），PBS清洗后加入混合抗体(抗-CD14、CD56、CD19、CD8、CD235a），4 ℃孵育10 min，加入包被有人抗鼠IgG Ab的 Depletion Dynabeads，除去PBMC中非CD4＋T细胞，在上清中加入抗CD25 Dynabeads 4 ℃孵育25 min，将CD4细胞分选成CD25＋Tregs细胞和CD25－Treps细胞，流式细胞仪鉴定分离细胞纯度。

pbmc分离方法及原理_分离pbmc用pbs稀释的目的

pbmc名词解释

外周血单个核细胞（PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。注意这里是 mononuclear cell 单个核细胞，而不是 Monocyte 单核细胞。外周血单个核细胞主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法。 扩展资料 基本原理：

外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其比重为1.070左右，而红细胞和多核白细胞的比重超过1.080。这样利用介于两者比重之间的溶液(称为分层液)做密度梯度离心，就可得到单个核细胞。常用的分层液为聚蔗糖和泛影酸钠混合比重为1.070±0.001的.溶液，国内常用泛影葡胺代替泛影酸钠。

注意事项：

1、在分离外周血单个核细胞过程中，将稀释血液加于分层液上时，要避免冲散分层液面，而要使之形成良好的界面，否则影响分离结果。

2、此法作得当，单个核细胞得率可达80%-90%，影响得率重要的因素是分层液的比重。

要做PCR的血液标本如何保存

采集血液的时候加入抗凝剂，防止血液凝固，然后4度5000rpm离心收集细胞，然后保存于-80度超低温冰箱里。

再拿出来提取DNA用于做PCR就好。

提取血液的DNA是针对血液里的白细胞，红细胞是没有细胞核的，将白细胞直接分离出来提DNA效果会更好一点。其实凝固的全血也是能够提出DNA的，但是产率和质量可能会低。

提取DNA的时候是保持样品新鲜，-20度不是长期保存组织的方法，还是-80度保存样品。

ficoll密度梯度离心法

利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得 PBMC。

根据细胞密度的不同进行分离。单个核细胞的体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。

用 Ficoll 分离人外周血中淋巴细胞时，血液样品和Ficoll的比例：①按照样品：Ficoll 的高度比约为 3:2.4 或体积比 4:3 的比例进行样品和分离液的添加；②大体积样品可以通过增加离心管的直径来进行分离，保持同样的高度比例。增加离心管直径并不影响所需的分离时间。