大抽质粒的目的 质粒大抽浓度很低

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大抽质粒的目的 质粒大抽浓度很低

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1、大提质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。

2、碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构异来分离的。

3、在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。

4、虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。

5、当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被基硫酸盐包盖。

6、当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

7、煮沸法裂解：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。

8、加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。

9、但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体白质，就可从上清中回收质粒DNA。

10、煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

11、小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。

12、同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。

13、但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

本文到这结束，希望上面文章对大家有所帮助。