共聚焦显微镜成像原理 共聚焦显微镜使用说明

激光共聚焦显微镜原理

以共聚焦显微技术为原理的共聚焦显微镜主要采用3D捕获的成像技术，它通过数码相机针孔的高强度激光来实现数字成像，具有很强的纵向深度的分辨能力。

共聚焦显微镜成像原理 共聚焦显微镜使用说明

共聚焦显微镜成像原理共焦显微镜装置是在被测对象焦平面的共轭面上放置两个小孔，其中一个放在光源前面，另一个放在探测器前面，如图所示。

共焦显微镜光路示意图

得到的图像是来自一个焦平面的光通过针孔数码相机聚焦拍摄，通过所累积的不同焦平面的图像序列，使用软件编译完整的 3d 图像。

共聚焦显微镜的基本原理

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

激光共聚焦显微镜的工作原理是什么？如何准备流式细胞的实验样品

采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

激光共聚焦显微镜的原理

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，激光扫描共聚焦显微镜光路图采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。

激光可以代替日光和灯光等。冷光源用激光可以加大分辨率。

请问共聚焦是什么意思？

是指光路（激发和发射）在两个位置上聚焦。在共聚焦扫描仪中，激发光聚焦在样品点表面，而发射光聚焦在针孔上。

这一针孔限制仪器在样品表面的聚焦深度，有效防止杂质信号（如灰尘荧光、样品背面的污染、玻璃的荧光信号、空气中常见的灰尘颗粒和来自扫描仪光学组件的荧光污染）产生的背景噪音干扰，从而降低背景信号的强度。

是指光路（激发和发射）在两个位置上聚焦。在共聚焦扫描仪中，激发光聚焦在样品点表面，而发射光聚焦在针孔上。这一针孔限制仪器在样品表面的聚焦深度。

就是一起去一家买焦炭的意思。

共聚焦，就是共同关注的话题。

显微镜的成像原理是什么？

共聚焦显微镜主要采用3D捕获的成像技术，它通过数码相机针孔的高强度激光来实现数字成像，具有很强的纵向深度的分辨能力。

共聚焦显微镜成像原理

共聚焦显微镜装置是在被测对象焦平面的共轭面上放置两个小孔，其中一个放在光源前面，另一个放在探测器前面，如图所示。

共焦显微镜光路示意图

得到的图像是来自一个焦平面的光通过针孔数码相机聚焦拍摄，通过所累积的不同焦平面的图像序列，使用软件编译完整的 3d 图像。

共焦显微镜系统所展现的放大图像细节要高于常规的光学显微镜。在相同物镜放大的条件下，共焦显微镜所展示的图像形态细节更清晰更微细，横向分辨率更高。

物镜是决定显微镜性能的重要部件，安装在物镜转换器上，接近被观察的物体，故叫做物镜或接物镜。

物镜的放大倍数与其长度成正比。物镜放大倍数越大，物镜越长。

光学显微镜（Optical Microscope，简写OM）是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。

1．物镜的分类

物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜；其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜（常用放大倍数为90—100倍）。

根据放大倍数的不同可分为 低倍物镜（10倍以下）、中倍物镜（20倍左右）高倍物镜（40—65倍）。

根据像矫正情况，分为消色物镜（常用，能矫正光谱中两种色光的色的物镜）和复色物镜（能矫正光谱中三种色光的色的物镜，价格贵，使用少）。

2、物镜的主要参数：

物镜主要参数包括：放大倍数、数值孔径和工作距离。

①、放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。

显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

②、数值孔径也叫镜口率，简写NA 或A，是物镜和聚光器的主要参数，与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05-0.95，油浸物镜（香柏油）的数值孔径为1.25。

③、工作距离是指当所观察的标本清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关，物镜的焦距越长，放大倍数越低，其工作距离越长。例：10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17，其中10为物镜的放大倍数；0.25为数值孔径；160为镜筒长度（单位mm）；0.17为盖玻片的标准厚度（单位 mm）。10倍物镜有效工作距离为6.5mm，40倍物镜有效工作距离为0.48mm 。3、物镜的作用是将标本作第一次放大，它是决定显微镜性能的重要的部件——分辨力的高低。

分辨力也叫分辨率或分辨本领。分辨力的大小是用分辨距离（所能分辨开的两个物点间的小距离）的数值来表示的。在明视距离（25cm）之处，正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点，这个0.073mm的数值，即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。

显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

当用普通的照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA

式中d——物镜的分辨距离，单位 nm。

λ——照明光线波长，单位 nm。

NA ——物镜的数值孔径

例如油浸物镜的数值孔径为1.25，可见光波长范围为400—700nm ，取其平均波长550 nm，则d=270 nm，约等于照明光线波长一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。

（二）、目镜

因为它靠近观察者的眼睛，因此也叫接目镜。安装在镜筒的上端。

1．目镜的结构

通常目镜由上下两组透镜组成，上面的透镜叫做接目透镜，下面的透镜叫做会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑（它的大小决定了视场的大小），因为标本正好在光阑面上成像，可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针，用来指示某个特点的目标。也可在其上面放置目镜测微尺，用来测量所观察标本的大小。

目镜的长度越短，放大倍数越大（因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比）。

2．目镜的作用

是将已被物镜放大的，分辨清晰的实像进一步放大，达到人眼能容易分辨清楚的程度。

常用目镜的放大倍数为5—16倍。

3．目镜与物镜的关系

物镜已经分辨清楚的细微结构，假如没有经过目镜的再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚，所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点，但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离，还是无法看清。所以，目镜和物镜即相互联系，又彼此制约

共聚焦显微镜的介绍

共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个 光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。

激光共聚焦显微镜的原理？

激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。

主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。

通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。