sp法实验目的 sps方法的具体过程

一抗、二抗

sp法实验目的 sps方法的具体过程

一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。

第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。

第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。

e.g.利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。

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你确定一抗主要有三点：

一是特异性识别你所要检测的蛋白质，

二是经生产商测试适用于免疫组化实验

三是如果你已经买好了二抗，确实你的一抗能够被二抗所识别

顺便说下，做血细胞的话用免疫组化有些怪，难道你用的是淋巴组织切片么？如果是单个细胞的话用流式细胞仪看免疫荧光比较好。

在实验室里，常采用加热高锰酸钾的方法制取氧气。实验步骤是：

（1）检查过气密性之后在试管中装入少量高锰酸钾，并在试管口放一团棉花，用带有导管的塞子塞紧管口。把试管口略向下倾斜固定在铁架台上。

（2）将两个集气瓶分别盛满水，并用玻璃片盖住瓶口。然后把盛满水的瓶子连同玻璃片一起倒立在盛水的水槽内。

（3）给试管加热。先使酒精灯火焰在试管下方来回移动，让试管均匀受热，然后对高锰酸钾所在的部位加热。

（4）导管口开始有气泡放出时，不宜立即收集，当气泡连续地并比较均匀地放出时，再把导管口伸入盛满水的集气瓶里。等瓶子里的水排完以后，在水面下用玻璃片盖住瓶口。小心地把瓶子移出水槽，正放在桌子上。用同样的方法再收集一瓶氧气。

（5）停止加热时，先要把导管移出水面，然后再熄灭酒精

将高锰酸钾放入烧瓶中加入Mno2加热制取氧气。

利用高锰酸钾制取氧气和检验氧气的方法

免疫组化原理

免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后用HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过与DAB显色剂反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。

免疫组化更多的意义在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western来实现。

免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位，组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。

通俗的讲，HE仅仅是看大体病理改变，比如组织坏死，比如炎性渗出。免疫组化，看你的目的蛋白的表达情况。

免疫组化和****HE****染色的对比

DAB和HE一样也是一种染色剂，HE染色相对简单，能分辨出细胞中的嗜酸嗜碱性物质；DAB染色全称应该叫做免疫组化DAB染色，经过一系列复杂的生化反应后，DAB(二氨基联苯胺)染色剂能将辣根过氧化物酶染成棕色。

常用的免疫组化染色方法:

组化用HRP的话，信号不够强。通常用生物素标记HRP来增强信号。

1、 ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法）

ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力特性，与生物素化二抗结合，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。

复合物配制：先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。

2、 SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物）

本身没有连接生物素，但有两个生物素亲和力极高的结合位点，可以与二抗上的生物素结合，敏感性高，复合物不需要使用前混合，更为简便。

3、 PAP法

4、 直接法

样本制备

免疫组化结果分析

免疫组化结果的判断原则：

1 、必须设阳性对照和阴性对照。

2 、 抗原表达必须在特定部位。

3 、 阴性结果不能视为抗原不表达。

免疫组化染色实验组与对照组结果分析表

从表可以看出只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用Ab。

染色失败的几种情况及原因:

1、 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。

2、 所有切片均呈阳性反应。

3、 所有切片背景过深。

4、 阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

所有切片呈阳性反应，其原因:

1、 切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。

2、 缓冲液配置中未加氯化纳和PH值不准确， 洗涤不彻底。

3、 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反 应时间过长。

4、 抗体温育的时间过长。

5、 H 2 O 2 浓度过高，呈色速度过快且粘附剂太厚。

所有切片背景过深，其原因:

1、 内源性过氧化酶没有完全阻断。

2、 切片或涂片过厚。

3、 漂洗不够。

4、 底物呈色反应过久。

5、 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

6 、使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

最常见的原因:标本固定和处理不当。

注意事项：

1、 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。

2、 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。

3、 以下原因可能导致片子着色不均匀：

①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中。

②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇。

③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂。④抗体孵育时，切片放倾斜。

⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。

⑥制片厚薄不均匀等问题。

⑦染片盒不平，切片倾斜。

4、 一抗的清洗:

1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

2、温柔冲洗，防止切片的脱落，推荐用浸洗方式。

3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。

5、 PBS的PH和离子强度的使用：

1、建议PH在7.4-7.6浓度是0.01 M。

2、中性及弱硷性条件（PH7-8）有利 于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利 于分解。

6、 拍照：

1、有条件的话应该立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

一·第二代聚合酶两步法（ PV，En Vision) PV－9000是2001年投入美国市场的，它是将二抗抗体分子的单价Fab段与酶聚合在一起，与一抗结合后，直接用底物进行显色的方法。此方法由于简单、快速、敏感性强且避免了内源性生物素所造成的背景染色，以有逐渐取代其他免疫酶组织化学检测方法的趋势。 PV法操作流程 1石蜡切片脱蜡至PBS。 2 0.3％H2O2甲醇液或3％H2O2室温孵育20min。 3 抗原修复。 4滴加适当稀释的一抗370C 60min或40C过夜。 5 PBS洗涤。 6 酶标记二抗370C 30min或室温60min。 7 DAB(0.04%)显色（镜检控制），水洗、复染、封片 二·sp法是一抗＋生物素化二抗＋HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素） 一般的sp法步骤啊,具体如下： 1.烤片，68℃，20分钟, 2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 3.阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min； 4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。 5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗. 6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）； 滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min; 7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min; 8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后， 苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。 三·检测试剂盒 灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今PV系列及SP试剂盒更优于其它试剂盒。检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。如一抗是鼠单或多抗的，二抗就应该是羊或兔抗鼠的。 四·建议选SP，亦可根据实验室习惯及在组织中的表达情况来定