贴壁细胞培养注意事项(贴壁细胞贴壁时间)

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

细胞培养是一种常见的生物技术，其步骤主要包括以下几个方面：

贴壁细胞培养注意事项(贴壁细胞贴壁时间)

常规准备：细胞培养基，胎牛血清，无菌作器具等；

细胞分离：将细胞悬浮液通过培养基离心分离并为单一细胞状态；

细胞计数：使用细胞计数板，显微镜等设备检测细胞浓度；

接种细胞：将细胞悬浮液加入预处理好的培养器皿中；

细胞培养及维护：放到合适的培养环境中，进行有利的生长处理（悬浮细胞与贴壁细胞的处理方式各有区别）

细胞检测及分裂：在一定时间内，对细胞进行检测，记录细胞数及细胞器发育情况；

细胞使用或保存：细胞可以在需要时被收获，进行进一步的科研工作，或保存在液氮罐中，以备后续使用。

进行细胞培养时，需要注意以下几点：

确保无菌作：细胞培养应在无菌环境下进行，必要时可使用生物安全柜进行作；

控制细胞温度：在适宜的器皿中提供恰当的温度，对于不同类型的细胞，温度和环境要求是不同的；

细胞培养基成分：细胞培养基中有多种成分，一些有组分具有强烈的耗竭作用，应及时更换培养基以供养细胞；

细胞处理方法：细胞处理时使用具有其细胞类型特异性的方法；

合适的接种密度：不同类型的细胞要求不同密度的接种，过高或过低的细胞密度均会对细胞的生长和分裂产生不良影响；

手套和口罩等保护作：需要保护自己以及细胞免于污染和交叉感染。

因此，在进行细胞培养时，需要细心、耐心和科学地作，这样才能够顺利地进行和成功地完成细胞培养工作。

细胞培养中有哪些要注意的问题？又该如何解决

细胞培养注意事项

1. 实验进行前，无菌室及无菌作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌作抬面，并开启无菌作台风扇运转10 分钟后，才开始实验作。每次作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌作抬面。作间隔应让无菌作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之作。

2. 无菌作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌作台内。实验作应在抬面之无菌区域，勿在边缘之非无菌区域作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是感染之细胞株应特别小心作，并选择适当等级之无菌作台(至少Class II)。作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水

动物细胞贴壁培养的方法有哪些

原代培养有两种

组织块培养法：

1）将上述剪好的小块放入15ml离心管中用10ml的Hanks洗液强有力的反复吹打,1000转离 心1分钟,弃去上清,重复一次.

2）用习惯将组织块放入25cm2 培养瓶中,竖起培养瓶,加入1-2ml培养液,培养箱中将培养瓶底朝上,放置2-4小时,小心将培养瓶方正,继续培养.

3）培养3-4小时后缓慢取出培养瓶,加5ml培养液,继续培养.

4）三天后小心取出观察,搜集漂浮组织块,置入离心管中,400转离心3分钟,弃去三分之二 上清,补加5ml培养液,移入25cm2 培养瓶中继续培养.

消化培养法：

1）将上述剪好的小块放入15ml离心管中,加入5-10ml的IV胶原酶消化液,放入37℃水浴中不断震荡,联系观察一小时,直至组织块弥散开为止,每隔30分钟收集消化液.

2）400转离心4分钟,收集细胞沉淀,用Hanks洗液冲洗,并重复一次.

3）将收集的细胞沉淀,用培养液重悬,置于4°冰箱,直至消化全部结束.

4）将细胞悬液通过250目不锈钢钢筛,将滤液置于25cm2 培养瓶中,放入培养箱培养.

在细胞培养的过程中注意事项有哪些

1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。

2、无菌作。作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。

3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。

贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。

4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。

传代细胞培养还要注意：1、无菌作；2、控制消化时间；3、及时关注细胞生长状态

贴壁细胞怎样进行传代？

以下介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程,为自己所用的细胞系传代时，建议您严格遵守实验中所有产品附带的作说明,偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完全失败。

(1)传代前准备

用具紫外照射消毒(30min)：无菌培养瓶，15ml离心管，移液管，移液枪，枪头。

倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

(2)胰蛋白酶/EDTA消化

从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧)，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基，PBS缓冲液洗去残留的旧培养基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入6ml细胞完全培养基中止消化，消化时间为1-5min，具体以细胞而议，采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内，每分钟1000rpm，RT5min。

(3)制备细胞悬液及培养

吸取上清液丢弃，不要吸到底部的细胞沉淀，向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基，吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡，以1:2的比例进行分瓶。

(4)结果观察

第二天观察细胞情况，细胞培养换液时间一般2-3天。

(5)注意事项

1 严格无菌

2 适度消化：把握好消化液的浓度

3 吹打细胞动作要轻柔

你说的是动物细胞培养吗，如果是就要用胰蛋白酶处理，把细胞分散，然后把分散的细胞分成几个培养基中培养

动物细胞培养的注意事项

从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。

动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。

动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清.

动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。

基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶处理（消化），处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。

1.首先是无菌作。

2.胰酶消化时间不能过长。

3.看细胞的生长情况，及时换培养基或传代。