午禾科技：激光共聚焦显微镜l880可以看514左右波长的光吗

激光共聚焦显微镜l880可以看514左右波长的光吗

激光共聚焦显微镜分辨率高，但是扫描速度相对较慢；白光干涉仪相对分辨率较低。不过现在好多共聚焦显微镜可以同时具备这两种功能，比如日Lasertec的的Hybrid，莱卡也有类似的功能----午禾科技

午禾科技：激光共聚焦显微镜l880可以看514左右波长的光吗

谁可以解答一下激光共聚焦显微镜激发波长和观测波长是什么意思？

激光共聚焦显微镜成像时使用的是短波长激光激发目标（细胞、组织、荧光分子等）而发射出的荧光波长长于激发激光。这种显像现称为斯托克斯位移（因斯托克斯在1852年首次观察到而得名），即发射荧光较相应的激发光有明显的光谱红移。由于斯托克斯位移的产生，荧光发射波长总是大于激发光波长。

激光共聚焦显微镜的分辨率

激光扫描共聚焦显微镜采用聚焦后的激光光斑作为照明光源，同时在探测器前引入针孔将聚焦光斑外的干扰信号进行过滤，因此提高了图像信噪比，横向分辨率可达200nm左右。

激光共聚焦显微镜（LSC）是一种高分辨率非常普遍的显微技术。它采用激光束共聚于投影像中，从而达到快速和自动聚焦的目的，可以用于显微成像和定量分析。激光共聚焦显微镜可以更快地实现观察不可见的微小物体，其分辨率可以达到单位处纳米尺度，可以将微小物体变成清晰可见的超微结构。比如以分子尺度看细胞内分子机制，在癌症研究中可以用它准确定位细胞内的蛋白质，也可以全面的研究微生物的内部生物学结构，从而更好的了解微生物之间的关系。

LSC的分辨率取决于其投影物镜的质量。一般情况下，当投影物镜的折射率和空气之间的折光率距越小，实现的分辨率就越高。当它们的距小于10时，可以达到1nm的分辨率，甚至可以突破它，达到极高的分辨率。采用激光共聚焦显微镜的成像分辨率，得到的图像清晰度比传统的远小技术更高。因此，激光共聚焦显微镜是显微学的一项重要技术，它的分辨率对提高显微成像的清晰度起着重要作用。

激光扫描共聚焦显微镜技术的主要应用范围

三者都是点源逐点扫描成像，通过控制扫描驱动范围，调节放大倍数，主要区别

1、极限分辨率不同,

缘于放大信号源的异

激光共聚焦：极限分辨率

150nm.

扫描电镜：20nm~0.8nm.

原子力显微镜：极限分辨率0.1nm

2、扫描驱动方式不同

激光共聚焦：激光转镜控制激光扫描范围和扫描速度。

扫描电镜：电磁线圈控制电子束扫描范围和扫描速度，

原子力显微镜：压电位移传感器驱动样品台x,y

方向扫描，

3、立体成像的别

激光共聚焦：通过纳米精度步进电机驱动样品在z轴方向逐层成像，软件将设定的各层图像合成清晰立体图像。

扫描电镜：

单帧图像具有很大景深，但属于二维图像，通过立体对技术可实现三维成像。

原子力显微镜：成像的本质就是测量表面每个像素点的高低，描绘出立体形貌。

4、工作环境别

激光共聚焦和原子力显微镜可以在大气环境中进行测试样品

一般扫描电镜必须在高真空环境下进行测试样品

5、应用范围别

激光共聚焦：几倍

~几千倍，样品制备简单

扫描电镜

：几倍~几十万倍，样品制备稍微复杂一些，但总体也很简单。

原子力显微镜：几万倍~几千万倍，

要求样品非常平坦，样品制备很难。

6、价格

共聚焦光漂白怎么用

共聚焦显微镜与传统显微镜相比，具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点。随着软件开发和应用技术的完善，共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

共聚焦显微镜的样品制备

共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

标本可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养，细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm，使用的盖玻片厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，而且表面光洁，厚度均匀，没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

常规样品制备要求：

1、染料的选择

由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题。

2、样品承载物的选择

一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

3、封片剂的选择

如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失。

共聚焦显微镜的操作步骤

①根据荧光探针的激发波长和发射波长，选择合适的激光器、激光功率，分光镜滤片和发射滤片。

②确定扫描方式：点、线、面、三维扫描。

③确定扫描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048，分辨率越高，扫描速度越慢，图像信噪比越好，但也越容易发生光漂白。

④选取共聚焦显微镜物镜的倍数及电子放大倍数:这个条件被确定后，扫描范围即被确定，物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此，应尽量选择高数值孔径的物镜。

⑤根据样品的制备质量选择合适的针孔大小，

为什么激光共聚焦显微镜拍不了360波长

激光扫描共聚焦显微镜与普通显微镜相比，激光共聚焦采用了能到达分辨率及重复性的无色扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。

我室引进的Leica TCS SP2型激光共聚焦配有全自动DMIRBE2新型光学显微镜系统；Leica TCS SP2 AOBS扫描头；四通道荧光共焦检测器及一个投射光DIC检测器；八通道AOTF调节器；电脑主机及双屏显示器。可进行组织和细胞的微分干涉及荧光的断层扫描；多重荧光的断层扫描及重叠；实时动态扫描及其动态构建；组织与细胞的三维动态结构构建；荧光共振能量转移的分析（FRET）；图像漂白后的荧光修复（FRAP）等。功能强大，性能优良。但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说有些复杂，操作过程中多会出现以下问题。