流式细胞术的基本原理及制备方法

流式细胞术原理

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代的细胞定量分析技术之一。

流式细胞术的基本原理及制备方法

光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。

基本结构：流式细胞仪由三部分构成：液流系统，包括流动室和液流驱动系统；光学系统，包括激发光源和光束收集系统；

电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。

用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。

流式细胞术的基本原理

流式细胞术是一种利用流式细胞仪对细胞进行分析和排序的技术。它是一种高通量、快速、、灵敏的细胞分析技术，被广泛应用于生物医学研究领域。流式细胞术的基本原理是通过细胞特异性荧光染色或其他标记技术，将细胞分为不同的群体，并利用流式细胞仪进行多参数分析和排序。

流式细胞术的基本步骤包括：

细胞样品的制备：将需要进行分析和排序的细胞样品制备成单细胞悬液，保证细胞在流式细胞仪中流动时不会聚集在一起。

细胞荧光染色或标记：利用荧光染料、抗体或其他标记技术，将细胞标记成不同的类型。每种标记有自己特定的激发波长和发射波长，可用于检测和区分不同类型的细胞。

细胞悬液的注射和流动：将细胞悬液通过注射器注入到流式细胞仪中，通过高速气流的作用将细胞分散并带动其流动，进入到流式细胞仪的检测区域。

细胞流式分析：细胞通过流式细胞仪的检测区域时，被激光束激发，产生荧光信号，同时检测器检测并记录荧光信号的大小和特征，以及细胞的散射光信号，从而对不同类型的细胞进行鉴定、分析和排序。同时，可以通过多参数检测和分析，得到更多的细胞信息。

细胞分选：根据需要，可以将不同类型的细胞进行分选，常用的分选方式有电荷静电分选、压缩空气分选、磁珠分选等。分选后的细胞可以用于进一步的实验或应用。

总之，流式细胞术的基本原理是将细胞标记成不同类型并通过流式细胞仪进行多参数分析和排序。它是一种高效、高通量、、灵敏的细胞分析技术，可以广泛应用于生物医学研究、临床诊断、生物安全等领域。

流式细胞术原理

FSC通道

FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的 大小 。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。

SSC通道

SSC，即侧向角散射，它的值代表 细胞的颗粒度 （granularity）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。

检测样品中是否含有细胞表达某一CD分子——标记荧光素偶联的该CD分子的抗体——表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体——荧光素被相应的激光激发后产生荧光——荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，——反映细胞上结合的荧光素的量，反映细胞上表达该CD分子的量——间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征

不同细胞群的FSC值和SSC值多相几倍，而荧光信号强弱之间一般相很大，阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相几十倍、几百倍，甚至几千倍，呈指数关系。 流式图数轴上FSC值和SsC值以“一般数序形式”表示，而荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示

流式直方图的x轴表示一个通道的值,y轴表示细胞数量。

流式直方图只能表示一个通道的信息，而流式散点图能够同时表示两个通道的信息，可以非常直观地发现细胞群体中这两个通道值的相互高低关系，从而更易于细胞分群、分类，以及确定比例关系等。

流式散点图也是采取坐标轴的方式，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。

环线聚集越多的地方表示此区域细胞密度变化越快，细胞稀疏的地方还是用散点表示，环线的区域代表细胞聚集的中心

流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。

流式细胞术原理

流式细胞术公开课

会形成鞘液流（鞘液是为了保证细胞在中间形成单个排列的细胞流，因为要保证激光覆盖整个样本中心流）在外周，样本流在的层流状态，使得样本仅在轴心

激光照射到样本流上，激光60um宽，20um高（宽高有限，只有样本流刚好在中间才能保证激光能覆盖样本流细胞）

样本流中的细胞表面的荧光抗体受到激光的照射以后，会被激发出荧光；

有两个镜头接受荧光信号，

一个是forward scatter-FSC检测器（前向散射光），另一个是side scatter-SSC侧向轴检测器/荧光信号检测器（与激光90度）

收集到的光信号就被光纤传导到光分离系统中去了，

光信号手机系统的内圈是长通滤片

中圈和外圈分别是带通滤片和PMT（啥？）

刚才细胞经过激光照射会有四个重叠的光谱，x轴是波长，y轴是强度

步，通过长通滤片，光信号被切割

第二步，经过带通滤片把特定波长的波过滤过来，不符合波长条件的波被反射

第三步，经过过滤的波，经过PMT转变成电信号，

PMT元件是电信号检测分析系统，

左边是光电转换膜，上下两边有不同的小电极，

侧边有电子检测器，

光信号转换成电信号的过程：

光子打到左边的光电转换膜上----> 膜上就会蹦出一个电子，这样就初步实现了光信号转变成电信号 ----> 电信号经过不同的电极就会反弹 ----> 电子经过反弹，电信号实现级联放大作用(通过调整电压可以调整终的电信号大小) -----> 检测器上就会形成一个电脉冲

表示电脉冲有三个参数：

峰宽+高度+峰下面积A；

常规的一般用峰下面积A来表示

下面是经过电信号转换的信号强度值，反映了每个荧光信号的强度；

每一行就是一个细胞，

每一行代表一个细胞，每一列的数值784～10229代表每个特定的PMT的荧光信号强度值；

两个PMT作为横纵坐标，可以根据荧光强度判定这两种荧光抗体结合细胞的比例；

一个细胞在轴上就是一个点，每一个点就代表一个细胞的位置，横纵坐标分别代表两个通道PMT的强度（选取的两个PMT）；

从下图可以看到黑乎乎的一团代表一种细胞，但具体的数字并不知道，为了弥补这个缺点呢，就出现了密度图

细胞越多用不同的颜色（伪色）表示，可以看到红色中心的细胞多，外周细胞少

把密度相等的点画成一条线

横轴代表荧光信号强度，纵轴代表细胞数量

试述流式细胞术(FCM)的工作原理及其特点。

原理：按检测需要标记了特异性荧光染料的单细胞悬液和鞘液，分别经硅化管进入流动室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳态单细胞液柱，该液柱以稳定的层流形式通过喷嘴高速射下，液柱与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单细胞上标记的荧光染料在通过激光光束时被激发而产生特异性荧光。同时，由于混合细胞群中细胞大小和胞内颗粒的多少会被激发而产生不同的散射光。在入射光束与液柱垂直方向有荧光检测系统和散射光感受系统，用于收集荧光信号，信号经光电倍增管转换成电压脉冲和积分脉冲，使信号放大。该信号进入计算机系统进行数据转换、储存、分析、处理，按不同的检测设计采用相应软件程序对结果进行综合分析。以图像和数据显示于荧光屏上，包括单参数和二维或三维图像资料、阳性细胞百分率、斜率、峰值、峰面积等多参数资料。

特点：能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号，对细胞进行定量分析或纯化分选。

试述流式细胞术加光学检测的原理及其优点。

原理：利用流式细胞术使单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液在通过激光照射的检测区时，使光束发生折射、衍射和散射，散射光由光检测器接受后产生脉冲，脉冲大小与被照细胞的大小成正比，脉冲的数量代表了被照细胞的数量。优点：①细胞是一个一个地通过激光检测区；避免了细胞重叠的可能性；②利用高、低角等前向散射光还可获得这个细胞的各种相关数据，经综合分析可进一步提高对细胞的鉴别功能。

流式细胞术原理

流式细胞术是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。

其特点是:，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。